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| Cat. Number | HK21161-48S |
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| Chemical Name | HK21161-48S NAD激酶(NADK)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/48S |
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| References | NAD激酶NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。 需自备的仪器和用品： 台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、 细菌、细胞或组织样本的制备： 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样本：直接检测。 二、试剂准备 1、试剂R3：用时加入3 mL 双蒸水，充分溶解，可分装保存，-20℃保存两周，禁止反复冻融；临用前取出一支稀释100 倍使用。 2、试剂R4：用时加入1 mL 双蒸水，充分溶解，4℃保存； 3、试剂R5：用时加入2 mL 双蒸水，充分溶解，4℃保存； 4、试剂R6：用时加入2 mL 双蒸水，充分溶解，4℃保存； 5、试剂R7：用时加入2 mL 双蒸水，充分溶解，4℃避光保存； 6、试剂R8：液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前加入0.986 mL 蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 7、试剂R10：自备95%乙醇； 8、标准品：加入1.9 mL 蒸馏水，即得2 μmol/mL NADP 标品。临用前稀释100 倍得20 nmol/mL NADP 标准溶液备用。 三、测定步骤 1、可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至570nm，95%乙醇调零。 2、标准品的配制：按照14、12、10、8、6、4、2、0nmol/mL。 3、操作表：（在EP 管中操作）
充分溶解沉淀后，放于微量比色皿或96 孔板中在570nm 下测定吸光值，分别记为A 测定，A 对照，A 标准，A空白，计算ΔA 测定=A 测定- A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。 四、NADK活性计算 1、标准曲线的绘制： 以NADP 标准品浓度为x 轴，ΔA 标准为y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA 测定带入公式得到x（nmol/mL）。 2、NADK活力的计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK（U/mg prot）=x×V 样本÷（Cpr×V 样本）÷T （2）按样本质量计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK（U/g 质量）=x×V 样本÷（W×V 样本÷V 提取）÷T （3）按细菌或细胞数量计算： 单位的定义：每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK（U/104 cell）=x×V 样本÷（500×V 样本÷V 提取）÷T （4）按血清（浆）体积计算： 单位的定义：每mL 血清（浆）在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK（U/mL）=x÷T V 样本：加入样本体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； W：样本质量，g； V 提取：加入的提取液体积； 500：细菌或细胞总数，500 万； T：反应时间，15min。 注意事项： 1. 样本的处理必须在0℃-4℃中操作完成，以防止酶变性失活。建议在正式实验前，选取差别较大的两个样本进行预实验。 2. 试剂R3、R4、R5、R6、R7、R8在测定过程中都必须在冰上放置。 3. 当初始吸光值大于0.4 时，建议将样本用PBS 稀释后测量。 4. 若测量样本数量过多，可以将试剂R2、R5、R6、R7按比例配成工作液使用。 本试剂盒仅供科研使用! |
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