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Cat. Number
HK21161-48S
Chemical Name
HK21161-48S NAD激酶(NADK)测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/48S
References

NAD激酶NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成NADP(H)。因此,NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。

测定原理:
NADK催化NAD+磷酸化,生成NADP+;NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH;NADPH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT),通过在600 nm下测定MTT的还原速度(吸光值的变化)可反映出NADK活性的大小。

需自备的仪器和用品:

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1液体×1 瓶2-8℃
试剂R2液体×1 瓶2-8℃
试剂R3粉剂×1 瓶-20℃
试剂R4粉剂×1 支-20℃
试剂R5粉剂×1 瓶-20℃
试剂R6粉剂×1 瓶-20℃
试剂R7粉剂×1 瓶2-8℃
试剂R8液体×1 瓶2-8℃
试剂R9液体×1 瓶2-8℃
试剂R10液体×1 瓶(自备)
标准品粉剂×1 支2-8℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、 细菌、细胞或组织样本的制备:

细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样本:直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R3:用时加入3 mL 双蒸水,充分溶解,可分装保存,-20℃保存两周,禁止反复冻融;临用前取出一支稀释100 倍使用。

2、试剂R4:用时加入1 mL 双蒸水,充分溶解,4℃保存;

3、试剂R5:用时加入2 mL 双蒸水,充分溶解,4℃保存;

4、试剂R6:用时加入2 mL 双蒸水,充分溶解,4℃保存;

5、试剂R7:用时加入2 mL 双蒸水,充分溶解,4℃避光保存;

6、试剂R8:液体置于试剂瓶内EP 管中。临用前加入0.986 mL 蒸馏水充分溶解,可分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

7、试剂R10:自备95%乙醇;

8、标准品:加入1.9 mL 蒸馏水,即得2 μmol/mL NADP 标品。临用前稀释100 倍得20 nmol/mL NADP 标准溶液备用。

三、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至570nm,95%乙醇调零。

2、标准品的配制:按照14、12、10、8、6、4、2、0nmol/mL。

3、操作表:(在EP 管中操作)

试剂名称(uL)测定管对照管标准管空白管
样本1010--
标准品--10-
蒸馏水---10
试剂R114242424
试剂R310---
试剂R46666
充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min,立即煮沸2min(盖紧,防止水分散失)。之后10000rpm 常温离心5min,取20μL 上清于1.5mL EP 管中,继续加入下列试剂。
试剂R250505050
试剂R515151515
试剂R615151515
试剂R715151515
试剂R87777
                                                                   室温避光静置20min。
试剂R9100100100100
                                         混匀静置5min,15000g,常温离心10min。去上清,留沉淀。
试剂R10200200200200

充分溶解沉淀后,放于微量比色皿或96 孔板中在570nm 下测定吸光值,分别记为A 测定,A 对照,A 标准,A空白,计算ΔA 测定=A 测定- A 对照,ΔA 标准=A 标准-A 空白。

四、NADK活性计算

1、标准曲线的绘制:

以NADP 标准品浓度为x 轴,ΔA 标准为y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b。将ΔA 测定带入公式得到x(nmol/mL)。

2、NADK活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK(U/mg prot)=x×V 样本÷(Cpr×V 样本)÷T

(2)按样本质量计算:

单位的定义:每g 组织在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK(U/g 质量)=x×V 样本÷(W×V 样本÷V 提取)÷T 

(3)按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK(U/104 cell)=x×V 样本÷(500×V 样本÷V 提取)÷T

(4)按血清(浆)体积计算:

单位的定义:每mL 血清(浆)在反应体系中每分钟产生1nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK(U/mL)=x÷T

V 样本:加入样本体积;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

V 提取:加入的提取液体积;

500:细菌或细胞总数,500 万;

T:反应时间,15min。


注意事项:

1. 样本的处理必须在0℃-4℃中操作完成,以防止酶变性失活。建议在正式实验前,选取差别较大的两个样本进行预实验。

2. 试剂R3、R4、R5、R6、R7、R8在测定过程中都必须在冰上放置。

3. 当初始吸光值大于0.4 时,建议将样本用PBS 稀释后测量。

4. 若测量样本数量过多,可以将试剂R2、R5、R6、R7按比例配成工作液使用。


本试剂盒仅供科研使用!

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