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Cat. Number
HK21159-96S
Chemical Name
HK21159-96S NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/96S
References

NADP-苹果酸脱氢酶MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH, NADP-MDH主要存在于真核细胞中。


测定原理:

NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。


需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/ 96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1液体×1 瓶2-8℃
试剂R2粉剂×1 支-20℃
试剂R3粉剂×1 支-20℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每200 万细菌或细胞加入400μL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30 次),8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样本:直接检测。

二、试剂准备

1.试剂R2:临用前加入500 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;

2.试剂R3:临用前加入600 μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。

三、测定步骤

1、酶标仪/紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、试剂R1置于37℃水浴中预热15min以上(保证无沉淀)。

3、操作表:

试剂名称(uL)测定管空白管
样本5-
蒸馏水-5
试剂R1185185
试剂R255
试剂R355

将上述试剂按顺序加微量石英比色皿/石英96 孔板中,充分吹打混匀后立即记录340nm 波长下初始吸光度A1 和反应1min 后的吸光度A2,计算ΔA 空白=A1 空白-A2 空白,ΔA 测定=A1 测定-A2 测定,计算ΔA=ΔA测定-ΔA 空白。(空白管测1-2 管即可)

四、NADP-MDH活力单位的计算

a.按微量石英比色皿计算:

1、血清(浆)NADP-MDH活力的计算

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(U/mL)=ΔA÷ε÷d×V反总÷V样÷T×109

ε:NADPH消光系数,6.22×103 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V反总:反应总体积;

V样:加入样本体积;

T:反应时间,1min;

109:单位换算系数,1mol=109nmol。

2、组织中NADP-MDH活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(U/mg prot)=ΔA÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T×109

(2)按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(U/g 质量)=ΔA÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V提取)÷T×109

ε:NADPH消光系数,6.22×103 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V反总:反应总体积;

V样:加入样本体积;

V提取:提取液体积;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;

W:样本质量,g;

T:反应时间,1min;

109:单位换算系数,1mol=109nmol。

3. 细菌或培养细胞中NADP-MDH活力的计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(U/104 cell)=ΔA÷ε÷d×V反总÷(200×V样÷V提取)÷T×109

ε:NADPH消光系数,6.22×103 L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V反总:反应总体积;

V样:加入样本体积;

V提取:细胞提取液体积;

200:细菌或细胞数量,200万;

T:反应时间,1min;

109:单位换算系数,1mol=109nmol。

b.按96孔板计算:

将上述公式中的比色皿光径d=1cm改为石英96孔板光径d=0.6cm进行计算.


注意事项:

1、样本的提取必须在0℃-4℃中操做完成,以防止酶变性失活。

2、实验时,试剂R2、试剂R3和样本在冰上放置,以免变性和失活。试剂R137℃放置。

3、建议一人加样一人比色。因时间监测范围小,不推荐用96 孔UV 板同时测多个样本。

4、用分光光度计时,当初始值小于0.7 或者ΔA 大于0.5 时,建议稀释后测量。


本试剂盒仅供科研使用!

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