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| Cat. Number | HK21159-96S |
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| Chemical Name | HK21159-96S NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | NADP-苹果酸脱氢酶MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH， NADP-MDH主要存在于真核细胞中。 测定原理： NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/ 96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200 万细菌或细胞加入400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样本：直接检测。 二、试剂准备 1．试剂R2：临用前加入500 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存； 2．试剂R3：临用前加入600 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。 三、测定步骤 1、酶标仪/紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、试剂R1置于37℃水浴中预热15min以上（保证无沉淀）。 3、操作表：
将上述试剂按顺序加微量石英比色皿/石英96 孔板中，充分吹打混匀后立即记录340nm 波长下初始吸光度A1 和反应1min 后的吸光度A2，计算ΔA 空白=A1 空白-A2 空白，ΔA 测定=A1 测定-A2 测定，计算ΔA=ΔA测定-ΔA 空白。（空白管测1-2 管即可） 四、NADP-MDH活力单位的计算 a.按微量石英比色皿计算： 1、血清（浆）NADP-MDH活力的计算 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/mL）=ΔA÷ε÷d×V反总÷V样÷T×109 ε：NADPH消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应总体积； V样：加入样本体积； T：反应时间，1min； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 2、组织中NADP-MDH活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T×109 （2）按样本质量计算： 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V提取)÷T×109 ε：NADPH消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应总体积； V样：加入样本体积； V提取：提取液体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml； W：样本质量，g； T：反应时间，1min； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 3. 细菌或培养细胞中NADP-MDH活力的计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/104 cell）=ΔA÷ε÷d×V反总÷(200×V样÷V提取)÷T×109 ε：NADPH消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应总体积； V样：加入样本体积； V提取：细胞提取液体积； 200：细菌或细胞数量，200万； T：反应时间，1min； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 b.按96孔板计算： 将上述公式中的比色皿光径d=1cm改为石英96孔板光径d=0.6cm进行计算. 注意事项： 1、样本的提取必须在0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。 2、实验时，试剂R2、试剂R3和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂R137℃放置。 3、建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用96 孔UV 板同时测多个样本。 4、用分光光度计时，当初始值小于0.7 或者ΔA 大于0.5 时，建议稀释后测量。 本试剂盒仅供科研使用! |
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