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| Cat. Number | HK21155-96S |
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| Chemical Name | HK21155-96S NADP磷酸酶(NADPase)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | NADP磷酸酶NADPase主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化NADP+降解为NAD+的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。 测定原理： NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、匀浆器/研钵和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 组织样本：称取约0.1g样本，加提取液1.0 mL充分研磨，于4℃，8000g离心10min，取上清液置冰上待测。 二、试剂准备 1、试剂R2：用时加入1.1 mL 试剂R1充分溶解备用，现配现用。 2、试剂R3：用时加入8 mL 双蒸水，溶解后4℃可保存一周。 3、试剂R4：用时加入8 mL 双蒸水，溶解后4℃可保存一周。 4、标准品：10 mmol/L 标准磷贮备液。将标准品10 倍稀释，即取1 mL 标准品加9 mL 蒸馏水，充分混匀，配成1 μmol/mL 标准磷应用液。 5、定磷试剂的配制：按H2O：试剂R3：试剂R4：试剂R5=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷试剂根据实验用量现用现配。 注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。 2、操作表：酶促反应
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min后，沸水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g常温离心10min，取上清。 3、定磷：
混匀，37℃水浴30min，冷却至室温，吸取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板总，在 660nm处记录各管吸光值，记为A标准管、A空白管、A测定管、A对照管，并计算ΔA标准=A标准管-A空白管，ΔA测定=A测定管-A对照管。（标准管、空白管只要做1-2次） 四、NADPase酶活性计算 1、按组织蛋白浓度计算： 定义：规定每分钟每毫克组织蛋白的组织中NADPase分解NADP产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。 NADPase (U/mg prot) =ΔA测定÷ΔA标准÷C标准×V上清÷（Cpr×V样本×V上清÷V酶促）÷T 2、按样本质量计算： 定义：规定每分钟每克组织中NADPase分解NADP产生1μmol无机磷的量为一个NADPase活力单位。 NADPase (U/g 质量) =ΔA测定÷ΔA标准÷C标准×V上清÷(W×V样本÷V提取×V上清÷V酶促)÷T C标准：1μmol/mL的磷标准应用液； V上清：定磷试验中上清液体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； V样本：酶促反应中样本体积； V酶促：酶促反应总体积； T：反应时间，20min； V提取：提取液体积； W：样本质量，g。 注意事项： 1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。 2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 本试剂盒仅供科研使用! |
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