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Cat. Number

HK21152-48S

Chemical Name

HK21152-48S NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

50T/48S

References

细胞色素P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR 作为P450 酶系的重要一员，催化氧化型P450 还原再生。

测定原理：
NCR 催化NADPH 还原氧化型细胞色素C，还原型细胞色素C 在550nm 处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR 活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、超速离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、粗酶液提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g 组织，加入4℃预冷的1mL 试剂R1，冰上充分研磨，10 000g，4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2 的沉淀中加1mL 试剂R1，盖紧后充分震荡溶解，100000g 离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3 的沉淀中加0.5mL 试剂R2，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，置于冰上待测。

二、试剂准备

1、试剂R1：临用前取一瓶加入50mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂4℃保存可保存4 周；

2、试剂R3：临用前取一支加入1300μL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2 周，避免反复冻融。

3、试剂R4：临用前取一支加入275μL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4 周，避免反复冻融。

三、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至550nm，用蒸馏水调零。

2、临用前根据实验用量取出部分试剂R2在37℃水浴中预热30min。

3、操作表：在1mL玻璃比色皿中依次加入：

试剂名称(uL)	空白管	测定管
蒸馏水	50	-
粗酶液	-	50
试剂R2	900	900
试剂R3	50	50
试剂R4	10	10
空白管：迅速混匀后于550nm 处测定2min 内吸光值变化，测定第10s 和第130s 吸光值，分别记为A1、A2。计算ΔA 空白=A2-A1。空白管只需做1-2 次。
测定管：迅速混匀后于550nm 处测定2min 内吸光值变化，测定第10s 和第130s 吸光值，分别记为A3、A4。ΔA 测定=A4-A3。