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| Cat. Number | HK21151-96S |
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| Chemical Name | HK21151-96S NADH氧化酶(NOX)测试盒(酶标板法) |
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| Qty 1 |
100T/96S |
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| References | NADH氧化酶NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1) 准确称取0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂R1和10μL 试剂R3，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2) 将匀浆600g，4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 3) 将上清液转移至另一EP 管中，即胞浆提取物，用于线粒体中泄露NOX 活性测定。 4) 沉淀即为线粒体，加入200μL 试剂R2和2μL 试剂R3，反复吹打充分混匀，用于NOX 活性测定，并用于蛋白浓度测定。 二、试剂准备 试剂R6：临用前加入4.5 mL双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。 三、测定步骤 1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。 2、试剂R4 37℃保温放置。 3、加样表：
将上述试剂按顺序在微量玻璃比色皿/96 孔板中操作，加入试剂六后立即混匀，同时开始计时，在600nm 波长下记录20秒时的初始吸光度A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中，准确反应1 分钟。迅速取出比色皿并擦干，记录1分20 秒时的吸光度A2。计算ΔA=A1-A2，记录ΔA 测定、ΔA 对照，ΔA=ΔA 测定-ΔA 对照。96孔板放于就近的恒温箱中，有些酶标仪带有内控温度设置的请设置为37℃，1 分钟后再次测量即可。 四、NOX 活力单位的计算 A 用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(Cpr×V样) ÷T V反总：反应总体积； V样：加入样本体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，1min。 B 用96孔板测定的计算公式如下 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V反总÷(Cpr×V样) ÷T V反总：反应总体积； V样：加入样本体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； T：反应时间，1min。 注意事项： 1、粗酶液的提取必须在0℃- 4℃中操作完成，以防止酶变性失活。 2、比色皿中反应液的温度最好保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。 3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 4、实验时，试剂R6样本在冰上放置，以免变性和失活。 5、因通过反应速率计算酶活，使用96 孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数量。 6、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 7、附：使用样本质量计算公式 A、按微量玻璃比色皿计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟A600 变化0.01 定义为一个酶活力单位。 NOX 上清（U/g 质量）=ΔA1÷0.01×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T NOX 沉淀（U/g 质量）=ΔA2÷0.01×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀 ΔA1：上清测定值； ΔA2：沉淀测定值； V 反总：反应总体积； V 样：加入样本体积； V提取：加入试剂R1体积； V 样总：沉淀重悬体积； W：样本质量，g； T：反应时间，1min。 B、按96 孔UV 板计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟A600 变化0.005 定义为一个酶活力单位。 NOX（U/g 质量）=ΔA1÷0.005×V 反总÷(W÷V 提取×V 样)÷T NOX（U/g 质量）=ΔA2÷0.005×V 反总÷(W÷V 样总×V 样)÷T NOX（U/g 质量）= NOX 上清+ NOX 沉淀 ΔA1：上清测定值； ΔA2：沉淀测定值； V 反总：反应总体积； V 样：加入样本体积； V提取：加入提取液体积； V 样总：沉淀重悬体积； W：样本质量，g； T：反应时间，1min。 本试剂盒仅供科研使用! |
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