HK21150-48S NADH氧化酶(NOX)测试盒(可见分光光度法)_上海惠诚生物生物试剂,标准品,仪器设备,耗材,一站式服务

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Cat. Number

HK21150-48S

Chemical Name

HK21150-48S NADH氧化酶(NOX)测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

50T/48S

References

NADH氧化酶NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：

NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
试剂R1	液体×1 瓶	4℃
试剂R2	液体×1 瓶	4℃
试剂R3	液体×1 瓶	-20℃
试剂R4	液体×1 瓶	4℃
试剂R5	液体×1 瓶	4℃
试剂R6	粉剂×2 瓶	-20℃

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1) 准确称取0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂R1和10μL 试剂R3，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2) 将匀浆600g，4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

3) 将上清液转移至另一EP 管中，即胞浆提取物，用于线粒体中泄露NOX 活性测定。

4) 沉淀即为线粒体，加入200μL 试剂R2和2μL 试剂R3，反复吹打充分混匀，用于NOX 活性测定，并用于蛋白浓度测定。

二、试剂准备

试剂R6：临用前加入4.5 mL双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。

三、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、试剂R4 37℃保温放置。

3、加样表：

试剂名称(uL)	测定管	对照管
试剂R4	700	700
试剂R5	100	100
样本	40	40
蒸馏水	-	160
试剂R6	160	-

将上述试剂按顺序在1mL玻璃比色皿中操作，加入试剂R6后立即混匀，同时开始计时，在600nm 波长下记录20秒时的初始吸光度A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中，准确反应1 分钟。迅速取出比色皿并擦干，记录1分20 秒时的吸光度A2。计算ΔA=A1-A2，记录ΔA 测定、ΔA 对照，ΔA=ΔA 测定-ΔA 对照。96孔板放于就近的恒温箱中，有些酶标仪带有内控温度设置的请设置为37℃，1 分钟后再次测量即可。

四、NOX 活力单位的计算

按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(Cpr×V样) ÷T

V反总：反应总体积；

V样：加入样本体积；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

T：反应时间，1min。

注意事项：

1、粗酶液的提取必须在0℃- 4℃中操作完成，以防止酶变性失活。

2、比色皿中反应液的温度最好保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。