服务热线
021-60498804
| Cat. Number | HK21147-96S |
||||||||||||
| Chemical Name | HK21147-96S L-半乳糖苷-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)测试盒(酶标板法) |
||||||||||||
| Qty 1 |
100T/96S |
||||||||||||
| References | L-半乳糖途径是合成 AsA 的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。 测定原理： Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原细胞色素c（Cyt c），还原型 Cyt c 在550nm有吸收峰；测定还原型 Cyt c 增加速率，来计算 Gal LDH 活性。 需自备的仪器和用品： 台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 称取约0.1g 样本，加提取液1mL，冰上充分研磨，13000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测。 二、试剂准备 1．试剂R1：临用前加入16 mL 蒸馏水，充分溶解； 2．试剂R2：临用前加入2 mL 蒸馏水，充分溶解。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550nm，蒸馏水调零。 2、按样本数取出一定量的试剂R1在25℃水浴锅中预热30 min以上，其余的分装保存(-20℃)。 3、空白管：依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、160μL预热的试剂R1和20μL试剂R2，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值，分别为A1，A2，ΔA空白管=A2-A1。 4、测定管：依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂R1和20μL试剂R2，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值，分别为A3，A4，ΔA测定管=A4-A3。 四、Gal LDH 活性计算 a.使用微量比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算： Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。 Gal LDH（U/mg prot）=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T （2）按样本质量计算 Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。 Gal LDH（U/g 质量）=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T ε：还原型Cyt c摩尔消光系数，17.3×103L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总：反应体系总体积； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定； W：样本质量，g； T：反应时间，2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。 Gal LDH (U/mg prot) = [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T （2）按样本质量计算 Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。 Gal LDH (U/g 质量) = [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T ε：还原型Cytc摩尔消光系数，17.3×103L/mol/cm； d：96孔板光径，0.6cm； V反总：反应体系总体积； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol； V样：加入反应体系中上清液体积； V样总：提取液体积； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定； W：样本质量，g； T：反应时间，2min。 注意事项： 1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的25℃蒸馏水，将此烧杯放入25℃水浴锅中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中；若使用96 孔板，反应期间应放入25℃培养箱中。 2、建议两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。 3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定OD 值。 本试剂盒仅供科研使用! |
||||||||||||
Copyright © 2022 上海惠诚生物科技有限公司
沪ICP备2021037845号-6
