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Cat. Number

HK21138-24S

Chemical Name

ATP含量测试盒(可见分光光度法)

Qty 1

50T/24S

References

ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。

测定原理：

HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，NADPH和ATP含量成正比，以此反应ATP含量。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水和氯仿。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R2	粉剂×1 瓶	2-8℃
试剂R3	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R4	粉剂×3 支	-20℃
试剂R5	粉剂×1 瓶	2-8℃
试剂R6	粉剂×3 支	-20℃
标准品	粉剂×1 支	-20℃

实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中ATP 的提取：按照血清（浆）体积(mL)：提取液体积(mL)为 1:5~10的比例（建议取约0.1mL 血清（浆)，加入1mL提取液)，充分震荡，10000g，4℃离心10min；取上清液至另一EP 管中，加入500uL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定)。

2、组织中ATP 的提取：按照组织质量（g)：提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液)，进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入500uL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定)。

3、细胞或细菌中ATP的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个)：提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液)，超声波破碎1min(冰浴，强度20%或200W，超声2s，停1s)，10000g 4℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入500uL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定)。

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加入7mL蒸馏水充分溶解，可加热促进溶解，用不完的试剂4℃保存4周;

2、试剂R4：临用前取1支加入0.2 mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融（1支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂)；

3、试剂R5：临用前加入3.2 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

4、试剂R6：临用前取1支加入0.25 mL蒸馏水备用，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融（1支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂);

5、标准品: 5 mg ATP。临用前加入0.826 mL蒸馏水配成10 umolmL的ATP标准溶液，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融;

6、工作液的配制：临用前请按试剂R2(mL)：试剂R3(mL)：试剂R4(mL)：试剂R5(mL)：试剂R6(mL)=1: 1:0.1: 0.4:0.1的比例配制（2.6mL，约50T的量)，现配现用。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2、将10umol/mL的 ATP标准溶液用蒸馏水稀释16倍即0.625umolmL标准溶液备用。

3、加样表：

试剂名称(uL)	测定管	标准管
样本	100	-
标准液	-	100
试剂R1	640	640
工作液	260	260
充分混合后，立即测定340nm下10s的吸光值A₁，然后将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴中反应3min，拿出擦拭干净立即测定其在3min10s时的吸光值A₂。用96孔板则放入37℃（哺乳动物）或25℃(其他物种）培养箱中（酶标仪若自带控温功能，则将温度调至37℃或25℃)。分别计算ΔA测定=A_2测定管-A_1测定管，ΔA标准=A_2标准管-A_1标准管。