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Cat. Number
HK21136-48S
Chemical Name
HK21136-48S ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒(紫外分光光度法)
Qty 1
50T/48S
References

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。


测定原理:

AGP催化的逆向反应生成G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体 ×1瓶2-8℃
试剂R1液体 ×1瓶2-8℃
试剂R2A粉剂×2 瓶2-8℃
试剂R2B液体 ×1瓶2-8℃
试剂R3粉剂×2 瓶2-8℃
试剂R4粉剂×2 支-20℃
试剂R5粉剂×2 支-20℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

称取约0.1g组织加入lmL提取液,冰浴中匀浆。10000g , 4C离心10min,取上清,置冰上待测。

二、试剂准备

1.试剂R2:临用前取1瓶试剂R2A加入试剂R2B充分溶解,用不完的试剂建议-20℃分装保存4周,避免反复冻融;

2.试剂R3:临用前取1瓶加3 mL蒸馏水充分溶解,用不完的试剂建议-20℃分装保存4周,避免反复冻融;

3.试剂R4:临用前取1支加入500uL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存4周,避免反复冻融。

4.试剂R5:临用前加入500uL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存8周,避免反复冻融。

三、测定步骤

1.紫外分光光度计预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.在EP管中按顺序加入下列试剂

试剂名称测定管
试剂R1100
试剂R2160
样本20
混匀,30℃保温15 min,置沸水浴中1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅速冷却后加入下列试剂(试剂一、试剂三置37℃保温10min以上。)
试剂R1300
试剂R3100
试剂R420
试剂R510

迅速混匀后在340nm波长下测定10s吸光值A1和130s吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。

四、AGP活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGP活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷T÷(Cpr×V样本)

(此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度)

2、按照样本质量计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGP活性(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷T÷(W×V样本÷V提取)

T:反应时间,15min;

ε:NADPH消光系数,6.22×10-3mL/nmol/cm;

V反总:反应总体积;

d:石英比色皿光程,1cm;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;

V样本:加入的样本体积;

V提取:加入的提取液体积;

W:样本质量,g。


注意事项:

1、 如果一次性测定样本较多,可以将试剂R1、R2按比例配成混合液1,将试剂R1、R3、R4和R5按比例配成混合液2。


本试剂盒仅供科研使用!

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