磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDH（EC 1.1.1.49）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是磷酸戊糖途径的关键酶，催化6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP+还原为NADPH，供生物合成及维持细胞内的还原状态用。因此6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。

测定原理：

G6PDH催化NADP+还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH增加速率。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞或组织样本的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30 次）。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样本：直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R2：用时每支加650 μL 双蒸水充分溶解备用；

2、试剂R3：用时每支加650 μL 双蒸水充分溶解备用。

3、工作液配制：临用前将试剂R1、试剂R2、试剂R3以15：0.2：0.2 比例混合。

三、测定步骤

1、紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2、试剂R1置于37℃水浴预热30min 以上。

3、加样表：

于340nm 处测定5min 内吸光值变化，第0s 吸光值记为A1，第300s 吸光值记为A2。记ΔA 测定=A2 测定-A1测定，ΔA 空白=A2 空白-A1 空白。

四、G6PDH 活力单位的计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）G6PDH 活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟生成1nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mL）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷V 样本÷T

2、组织中G6PDH 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mg prot）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷(V 样本×Cpr)÷T

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/g 质量）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷(W÷V 提取×V 样本)÷T

3、细菌或细胞中G6PDH 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mg prot）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷(V 样本×Cpr)÷T

（2）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/10⁴ cell）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷(V 样本×500÷V 提取)÷T

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；

d：1mL 石英比色皿光径，1cm；

V 反总：反应总体积；

V样本：加入样本体积；

T：反应时间，5min；

V 提取：加入提取液体积；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；

500：细菌或细胞总数，500 万；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

b.用96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）G6PDH 活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mL）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T

2、组织中G6PDH 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mg prot）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T

=1072×（ΔA 测定-ΔA 空白）÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g 组织每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/g 质量）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样÷V 提取×W)÷T

=1072×（ΔA 测定-ΔA 空白）÷W

3、细菌或细胞中G6PDH 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mg prot）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷(V 样本×Cpr)÷T

=1072×（ΔA 测定-ΔA 空白）÷Cpr

（2）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/10⁴ cell）=[（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×10⁹×V 反总]÷(V 样本×500÷V 提取)÷T

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；

d：96 孔板光径，0.6cm；

V 反总：反应总体积；

V样本：加入样本体积；

T：反应时间，5min；

V 提取：加入提取液体积；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；

500：细菌或细胞数量，500 万；

10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂R1 37℃水浴放置。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、若样本测定初始值（0s）大于0.5 而ΔA 测定小于0.1，可将样本稀释后再行测定。

5、使用96 孔板测定时，因是根据反应速率计算酶活，为保证每个样本的反应时间尽量一致不推荐同时测过多样本。

本试剂盒仅供科研使用!