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/ Products Classification 点击展开+Cat. Number | HK21131-96S |
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Chemical Name | HK21131-96S 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒(酶标板法) |
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Qty 1 |
100T/96S |
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References | 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶,广泛存在于动植物和微生物体内,催化1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸,产生1分子ATP,具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能,广泛应用于药物靶标设计。 测定原理: 3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP 产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP,1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH 作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸,引起340nm 处的吸光度下降,即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成:
实验步骤: 注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。 细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细胞加入1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3 秒,间隔7 秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。 血清/血浆:直接检测。 二、试剂准备 1、试剂R2:临用前加入2.5 mL 蒸馏水充分溶解后待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 2、试剂R3:临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 3、试剂R4:临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 4、试剂R5:粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入4 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融; 5、工作液的配制:按照蒸馏水:试剂R1:试剂R2:试剂R3:试剂R4:试剂R5=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀,现用现配。 三、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 2、样本测定:(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)
四、PGK活性计算 A、按微量石英比色皿计算: 1、按照样本蛋白浓度计算 酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T 2、按照样本质量计算 酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总) ÷T 3、按照液体体积计算 酶活单位定义:每mL 血清(浆)每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷V 样÷T 4、按照细胞数量计算 酶活单位定义:每104 个细胞每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(500×V 样÷V 样总)÷T V 反总:反应体系总体积,2×10-4L; ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm; d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积; V 样总:加入提取液体积; T:反应时间,5min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g; 500:500 万个细胞; 109:单位换算系数,1mol=109nmol。 B、按96 孔UV 板计算: 将上述公式中的d-1cm 改为d-0.6cm(96 孔UV 板光径)进行计算即可。 注意事项: 1. ΔA 大于0.8 或者A1 测定小于0.9 时(96 孔UV 板是当ΔA 大于0.5 或者A1 测定小于0.6 时),建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA 小于0.01 时,可以延长反应时间(10min 或15min)或增加样本体积来测定。 2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。 3. 样本的蛋白浓度需自行测定,由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。 本试剂盒仅供科研使用! |
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