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Cat. Number
HK21131-96S
Chemical Name
HK21131-96S 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒(酶标板法)
Qty 1
100T/96S
References

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶,广泛存在于动植物和微生物体内,催化1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸,产生1分子ATP,具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能,广泛应用于药物靶标设计。


测定原理:

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP 产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP,1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH 作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸,引起340nm 处的吸光度下降,即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。


需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96 孔UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1液体×1 瓶2-8℃
试剂R2粉剂×1 瓶-20℃
试剂R3粉剂×1 瓶-20℃
试剂R4粉剂×1 瓶-20℃
试剂R5粉剂×1 瓶-20℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细胞加入1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3 秒,间隔7 秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

血清/血浆:直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R2:临用前加入2.5 mL 蒸馏水充分溶解后待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

2、试剂R3:临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

3、试剂R4:临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

4、试剂R5:粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入4 mL 蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

5、工作液的配制:按照蒸馏水:试剂R1:试剂R2:试剂R3:试剂R4:试剂R5=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀,现用现配。

三、测定步骤

1、分光光度计/酶标仪预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定:(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)

试剂名称(uL)空白管测定管
工作液180180
样本-20
蒸馏水20-
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴或培养箱5min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃),拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2,计算ΔA测定管=A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次)

四、PGK活性计算

A、按微量石英比色皿计算:

1、按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T

2、按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

3、按照液体体积计算

酶活单位定义:每mL 血清(浆)每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷V 样÷T

4、按照细胞数量计算

酶活单位定义:每104 个细胞每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(500×V 样÷V 样总)÷T

V 反总:反应体系总体积,2×10-4L;

ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;

d:比色皿光径,1cm;

V样:加入样本体积;

V 样总:加入提取液体积;

T:反应时间,5min;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;

W:样本质量,g;

500:500 万个细胞;

109:单位换算系数,1mol=109nmol。

B、按96 孔UV 板计算:

将上述公式中的d-1cm 改为d-0.6cm(96 孔UV 板光径)进行计算即可。


注意事项:

1. ΔA 大于0.8 或者A1 测定小于0.9 时(96 孔UV 板是当ΔA 大于0.5 或者A1 测定小于0.6 时),建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA 小于0.01 时,可以延长反应时间(10min 或15min)或增加样本体积来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定,由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。


本试剂盒仅供科研使用!


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