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Cat. Number

HK21130-48S

Chemical Name

HK21130-48S 3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒(紫外分光光度法)

Qty 1

50T/48S

References

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

测定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP 产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH 作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，引起340nm 处的吸光度下降，即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品组成：

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R1	液体×1 瓶	2-8℃
试剂R2	粉剂×1 瓶	-20℃
试剂R3	粉剂×1 瓶	-20℃
试剂R4	粉剂×1 瓶	-20℃
试剂R5	粉剂×1 瓶	-20℃

实验步骤：

注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清/血浆：直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R2：临用前加入5 mL 蒸馏水充分溶解后待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

2、试剂R3：临用前加入2.5 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3、试剂R4：临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

4、试剂R5：粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入10mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

5、工作液的配制：按照蒸馏水：试剂R1：试剂R2：试剂R3：试剂R4：试剂R5=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀，现用现配。

三、测定步骤

1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定：(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)

试剂名称(uL)	空白管	测定管
工作液	900	900
样本	-	100
蒸馏水	100	-
在1吗L石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）

四、PGK活性计算

1、按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T

2、按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

3、按照液体体积计算

酶活单位定义：每mL 血清（浆）每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷V 样÷T

4、按照细胞数量计算

酶活单位定义：每104 个细胞每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。