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| Cat. Number | HK21128-48S |
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| Chemical Name | 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)测试盒(紫外分光光度法) |
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| Qty 1 |
50T/48S |
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| References | 3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。 测定原理： 3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 产品组成：
实验步骤： 注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 血清（浆）：直接检测。 二、试剂准备 1、试剂R3：液体置于试剂瓶内EP 管中。根据用量按照试剂R3：蒸馏水为3:100 的体积比例充分混匀，现用现配； 2、工作液的配制：将试剂R2全部倒入试剂R1瓶中，充分溶解，根据需要取一定的量37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 三、测定步骤： 1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、操作表（在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂）：
四、GAPDH 酶活计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 GAPDH 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T （2）按样本质量计算 酶活定义：每g 组织每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 GAPDH 酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T （3）按照细菌或细胞数量计算 酶活定义：每104 个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 GAPDH 酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷（500×V 样÷V 样总）÷T （4）按液体体积计算 酶活定义：每mL 样本每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。 GAPDH 酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷V 样÷T ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/ mol /cm； d：比色皿光径，1cm； V 反总：反应体系总体积； V样：反应体系中样本体积； V 样总：加入提取液体积； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定； W：样本质量，g； T：反应时间：5min； 500：细菌或细胞总数，500 万； 109：单位换算系数，1mol=109nmol。 注意事项： 1、当A1 小于0.8 或ΔA 大于0.7 时（96 孔板为A1 小于0.4 或ΔA 大于0.4），建议将样本稀释后再进行测定。 2、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.02。 本试剂盒仅供科研使用! |
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