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Cat. Number
HK21128-24S
Chemical Name
HK21128-24S 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)测试盒(紫外分光光度法)
Qty 1
25T/24S
References

3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途径的关键酶,与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关,在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。


测定原理:

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD,340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH活性的高低。


需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。


产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体×1 瓶2-8℃
试剂R1粉剂×1 瓶-20℃
试剂R2液体×1 瓶2-8℃
试剂R3液体×1 瓶2-8℃


实验步骤:

注意:实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心20min,取上清,置冰上待测。

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

血清(浆):直接检测。

二、试剂准备

1、试剂R3:液体置于试剂瓶内EP 管中。根据用量按照试剂R3:蒸馏水为3:100 的体积比例充分混匀,现用现配;

2、工作液的配制:将试剂R2全部倒入试剂R1瓶中,充分溶解,根据需要取一定的量37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

三、测定步骤:

1、分光光度计预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、操作表(在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂):

试剂名称(uL)空白管测定管
样本-30
蒸馏水30-
试剂R32020
工作液950950
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm 处测定10s 时的吸光值A1,迅速置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴或培养箱5min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃),拿出迅速擦干测定5min10s 时的吸光值A2,计算ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。(空白管只需做1-2 次)

四、GAPDH 酶活计算:

(1)按蛋白浓度计算

酶活定义:每mg 组织蛋白每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH 酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T

(2)按样本质量计算

酶活定义:每g 组织每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH 酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)÷T

(3)按照细菌或细胞数量计算

酶活定义:每10个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH 酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T

(4)按液体体积计算

酶活定义:每mL 样本每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH 酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V 反总÷V 样÷T

ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/ mol /cm;

d:比色皿光径,1cm;

V 反总:反应体系总体积;

V样:反应体系中样本体积;

V 样总:加入提取液体积;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度需自行测定;

W:样本质量,g;

T:反应时间:5min;

500:细菌或细胞总数,500 万;

109:单位换算系数,1mol=109nmol。


注意事项:

1、当A1 小于0.8 或ΔA 大于0.7 时(96 孔板为A1 小于0.4 或ΔA 大于0.4),建议将样本稀释后再进行测定。

2、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.02。


本试剂盒仅供科研使用!


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