RPA/RAA和RT-RAA扩增试剂盒_技术资料_新闻中心_上海惠诚生物生物试剂,标准品,仪器设备,耗材,一站式服务

重组酶介导链置换核酸扩增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一种恒温核酸快速扩增技术。RT-RAA先利用逆转录酶将 RNA 逆转录成 cDNA，从细菌或真菌中获得的重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合，形成重组酶/引物复合体，侵入RNA-cDNA双链核酸模板，在侵入位点重组酶将双链打开，同时单链结合蛋白结合到被重组酶打开的单链上，维持双链模板处于开链状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描，当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时，重组酶/引物复合体解体，DNA聚合酶结合到引物的3'端，开始合成新链。合成的新链又可以作为模板，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。经过荧光标记的探针与扩增产物结合，当探针被核酸内切酶酶切后，与生物素标记的引物共同扩增形成两端有荧光标记及生物素标记的片段，可用电泳法、荧光法或通用型核酸检测试纸条进行判读。如下图所示：

本试剂盒具有快速、灵敏度高以及特异性强等优点，反应组分已混合并冷冻干燥成核酸扩增试剂，操作简便，易于保存。

引物设计

RAA核酸扩增技术对引物设计的要求与常规PCR引物设计有一定的区别。由两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；引物长度在28-35 nt之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素。建议在开展RAA（基础型）扩增反应之前，先进行引物的筛选试验，以便得到较高的检测灵敏度。

探针设计建议方法：探针长度在46-52 nt之间，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；探针的5'端用一种抗原标记物标记，通常为FAM基团或羧基荧光素；内部含有碱基核苷酸类似物替换核苷酸（例如四氢呋喃残基THF-有时称为'dSpacer'）；3'末端有聚合酶延伸阻断基团（例如C3-spacer，磷酸基或双脱氧核苷酸）。如下图所示：

注意：在开始实验前检查探针5'端标记的基团与下游引物5'端标记的基团是否与所用的试纸条相匹配；建议在开展 RAA试纸条型扩增反应之前，先进行引物的筛选试验，以便得到较高的检测灵敏度。

产品说明

1. 本产品是“Ready to Use”即用型 RAA/RT-RAA 冻干颗粒；含有除引物和探针外所有的反应要素，如重组酶、DNA 聚合酶、逆转录酶、dNTP、ATP和PEG 35000等。

2. 试剂盒最低检测下限为 10-100copies/测试（依据引物筛选优化程度和检测手段）。

3. RAA试剂，仅扩增DNA，RT-RAA能同时扩增DNA和RAA。

4. 基础型试剂，适用于电泳法分析条带。

5. 荧光型试剂：含有外切酶（EXO）可使用探针法，进行实时荧光监测。

6. 试纸条型试剂：含有外切酶适用于荧光法和试纸条法分析扩增产物。

适用仪器

恒温金属浴、恒温水浴锅、荧光PCR仪。

检测步骤

1. 核酸样本提取：请参考传统RNA/DNA 提取方法或其他同效商品化试剂盒提取DNA/RNA样本。

2. 样本检测

2.1 反应体系：单管反应体系（25μL）：

2.2 操作步骤

2.2.1 根据反应数量，按照反应体系配制含有水、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM)的 Mix，混合均匀后加入装有核酸扩增试剂的检测单元管中；

2.2.2 向检测单元管中加入经步骤1处理得到的待测RNA样本；

2.2.3 再向检测单元管盖上加入1.5~2.5 μL 的Mg2+，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，低速离心10 sec；（注：本步骤“是否充分混匀”将决定实验结果的重复性）

2.2.4 将检测单元管放入37~40℃ 恒温金属浴（或恒温水浴锅）中，孵育30min。荧光法则每隔30秒，采集一次荧光信号。

2.2.5 试纸条检测：反应结束后，将25μL反应体系液用无菌水或者PBS稀释（25μL反应体系液:150μL稀释剂），利用通用型核酸检测试纸条进行检测。

结果分析与判定

可以根据琼脂糖电泳、试纸条或荧光法判定实验结果。