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Crispr Cas12b切割原理及与Cas12a的区别

Crispr Cas12b是一种新发现的DNA内切酶，也属于cas系列酶家族，是其CRISPR免疫系统中的效应酶。Cas12b是一个多功能蛋白，包含RNA结合域、核酸酶域和DNA结合域。其核酸酶域在激活后可以非专属性切割DNA。

Cas12b需要与特定的crRNA结合才具有酶活性，crRNA提供与靶DNA互补的序列，决定了其识别靶点。多个crRNA可以同时作用于一个Cas12b。Cas12b在结合crRNA前处于不活性状态。只有crRNA完全与靶DNA杂交后，其核酸酶域才被激活,内切DNA。激活的Cas12b会在crRNA结合位点产生双链断裂，切出一段DNA片段，然后会继续非专属性内切周围的DNA，产生较短片段。Cas12b在激活后会逐渐失去活性，这在一定程度上限制了其非专属性DNA内切范围，但在高DNA浓度条件下，仍可产生较大范围的非专属性切割。Cas12b可用于DNA高灵敏度检测、基因编辑、转基因等。crRNA设计决定其靶向性，继而影响应用效果。但非专属性切割也需在应用设计中控制。

Cas12b切割原理如下:

1. Cas12b与crRNA结合形成RNP复合体，crRNA提供DNA识别的序列信息。只有当crRNA与靶DNA完全碱基配对时，Cas12b才会被激活。

2. 激活的Cas12b会在靶DNA与crRNA结合部位产生内切，切出两段DNA片段。这是其DNA识别功能的体现。

3. 激活后的Cas12b也会对周围其他DNA分子进行非专属性切割，产生较短的DNA片段。这被称为旁观切割或背景减噪效应。

4. Cas12b本身在DNA内切后也会被降解。这是其一个自我限制机制，可以在一定程度上遏制旁观切割效应。

5. 利用高通量测序等方法可以检测到上述DNA片段，判断靶DNA是否存在及表达水平。这实现了对DNA的检测。

6. 利用不同crRNA可以实现对不同DNA的识别，这决定了该系统的多功能性。多个crRNA也可以成簇使用，提高检测灵敏度。

7. Cas12b会在发现靶DNA后持续进行DNA内切，这产生信号放大效应，增强了检测灵敏度。但也增加了旁观切割风险。

Cas12b是一个可根据crRNA指导进行DNA切割的RNP复合体。在靶DNA的指导下，其核酸酶域会被激活并进行DNA内切，实现了对靶DNA的高效识别和放大。这一原理使其可以作为DNA诊断工具，crRNA的设计决定了其特异性。但是其附带切割效应也使非专属性信号放大成为可能,这需要在应用中加以考量。

Cas12b与Cas12a是两种不同的DNA内切酶，均属于cas系列酶家族。

Cas12b在某些方面比Cas12a具有优势:

1. DNA内切效率更高

Cas12b在激活后可以更高效率地内切DNA，产生更多的DNA片段。这增强了其作为DNA检测工具的灵敏度。

2. crRNA设计更简单

Cas12b只需要一个crRNA就可以实现DNA的有效内切，而Cas12a常需要两个crRNA(tracrRNA与crRNA)才能产生足够的内切活性。这简化了crRNA设计过程。

3. 产生更自然的突变模式

Cas12b产生的DNA突变模式更接近自然发生的突变，这有利于其在基因编辑中的应用。而Cas12a产生的突变常有一定的序列偏好。

4. 内切产物更易于检测

Cas12b产生的DNA内切片段大小和数量更适于高通量测序检测，产生更强的信号。这为DNA检测提供了便利。

5. 较少碱基偏好

Cas12b对DNA识别序列有较少的碱基偏好，这增大了其识别范围,利于在基因组水平的应用。Cas12a的碱基偏好更强。

Cas12b也存在一定局限:

1. 非专属性切割效应较强

Cas12b激活后对周围DNA的非专属性切割效应较强，这会产生较高的背景噪音，影响检测精度和基因编辑靶向性。

2. 对DNA浓度更敏感

Cas12b的活性及非专属性切割效应更容易受DNA浓度的影响，在高浓度DNA条件下，其非专属性切割范围会更广。这也影响其应用精密性。

3. 目前研究更少

相比Cas12a，Cas12b的研究报道还比较少，相关技术也较为初步,有待进一步探索其潜力和改进空间。

进一步研发Cas12b系统，提高其专一性与精密度控制，并与Cas12a相结合，将有助于更好发挥这两种酶的优势,满足不同的应用需要，真正实现DNA技术的多功能发展。