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/ Products Classification 点击展开+培养基在过滤的过程中有可能受有毒物质的污染。例如，一些滤器为了容易保持湿润而用微量去污剂处理过，当过滤培养基时，这些去污剂可能会进入培养基中。这种滤器应该在使用前先过滤一些D-PBSA或BSS达到清洗的目的，或者是弃掉前面的过滤液。聚碳酸酯滤器(如 Nuclepore)不用去污剂处理即可湿润，一些人喜欢用它，尤其是在过滤血清浓度低的培养基时。
培养物检测主要有3种形式：①贴瓶率；②在正常培养密度和达到饱和密度时的生长曲线；③特殊功能的表达(例如，诱导剂存在下的分化，病毒繁殖，特殊产物形成或特异抗原表达)。所有这些对新培养基的检测都应以常规培养基作为对照。
贴瓶率检测是最敏感的培养检测，可检测到轻微的营养不足和低浓度的毒素，这些在细胞密度较高时是不明显的。这种检测最好应在有限的血清浓度下进行(如果需要使用血清)，否则会掩盖培养基中的营养不足。接下来用A549细胞来进行测试，在10%血清培养条件下，其贴瓶率大约为50%，5%时贴瓶率大约为10%，但最好先测定一下将用于实验的细胞的贴壁率，并且是在限制血清浓度(如5%)的条件下。
用贴瓶率测试培养基具体如下：
概要
接种低密度细胞，温育至集落形成；染色，统计集落数。
材料
无菌
贴壁细胞，如A549，培养至对数期(参见图2)
对照生长培养基;常规的DMEM/F12 5% FBS 100mL
测试生长培养基:常规的 DMEM/F12 含 5% FBS 100mL
粗制胰蛋白酶，0.25% 10mL
Petri培养皿，6cm 20个
试管或常规容器，用于稀释20
红细胞计数器或电子细胞计数仪
固定用无水甲醇 100mL
D-PBSA 200mL
染液:结品紫100mL
过滤漏斗和滤纸(用于回收染液)
操作步聚
1.胰蛋白酶消化细胞产生单细胞悬液。
2.细胞消化的过程中：
(a)在培养皿的底部做上标记:
(b)量出培养基用于稀释，每个稀释度需要3份，培养基要够用有余。
3.细胞变圆开始脱落:
(a)用含血清或某种胰蛋白酶抑制剂的培养基吹打单层细胞:
(b)细胞计数;
(c)将细胞稀释至
(i)2x104个/mL用于接种两个25cm培养瓶，常规培养;
(ii)2x103个/mL，是系列稀释的最高浓度;
(iii)用(ii)液稀释5个梯度，达到200个/mL、100/mL、5个/mL、20个/mL、10个/mL
4.接种至培养皿，每个皿5mL 培养基，分别含(iii)所制备的5种细胞浓度。接种两个6cm 培养皿，每个皿的细胞浓度为2x103个/mL，在克隆化培养失败时可作为对照(以证明至少在最高浓度时有细胞存在)。
5.用5%CO充入培养瓶，放到培养箱中。
6.将Petri培养皿放在透明的塑料盒中，再放置在温润的CO2温箱中，克隆化培养过程中最好少观察。
7.培养至肉眼可见细胞集落(1~3周)。
8.用结晶紫对集落进行染色。
(a)去除培养皿中的培养基。
(b)用D-PBSA 冲洗细胞，丢弃冲洗液。
(c)加5mL新鲜的D-PBSA，再加入5mL甲醇，轻轻混匀(避免集落脱落)。
(d)用5mL 新鲜的甲醇替换50:50(D-PBSA:甲)的混合液，固定细胞10min。
(e)丢弃甲醇，每个6cm培养皿加入纯的结品紫染液 2-3mL，确认覆盖了整个生长表面。
(f)染色10min。
(g)移除染液，将染液过滤后回收至染液瓶中。
(h)用水冲洗培养皿，干燥。
9.统计每个皿中的集落数，不包括小于50个细胞的集落。使用放大查看器有助于统计集落数。
注意事项：必须设置一个临界值，高于此数值的可以统计在内。如果大多数集落的细胞数在一百至几千，就将临界值设置在每个集落 50个细胞。在实践中，用肉眼观察时，很自然就会确定这个临界值。然而，如果集落很小(<100个细胞)，临界值就要设置在每个集落16个如细胞。低于16个细胞时(相当于细胞连续分裂4次)，难以想象这些细胞能够继续增殖。
如果将血清浓度降至5%，只有很小或没有影响，就再降至2%，甚至1%，再重复做实验，并把此浓度作为正确的有限浓度用于进一步的测试。一个克隆生长测试，不是总能测出某种成分的量的不足，除非测量克隆的大小。举例来说，如果一种或多种氨基酸的浓度偏低，可能不会影响贴瓶率测试，但会影响克隆大小的平均值。由于这个原因要进行生长曲线的测试。
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