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GB/T 5009.88 食品中膳食纤维测定用试剂盒

 

产品名称:总膳食纤维试剂盒Total Dietary Fiber Assay Kit   产品编号:K-TDFR,规格:200次检测

1. 简介:

膳食纤维是指碳水化合物及其相类似物质的总和,包括多糖、寡糖、木质素以及相关的植物物质。主要有纤维素、半纤维素、果胶及亲水胶体物质,如树胶、海藻多糖等组分;另外还包括植物细胞壁中所含有的木质素;不被人体消化酶所分解的物质,如抗性淀粉、抗性糊精、抗性低聚糖、改性纤维素、黏质、寡糖以及少量相关成分,如蜡纸、角质、软木脂等。

总膳食纤维检测试剂盒是根据AOAC991.43,AOAC 985.29,AACC32-07和AACC 32-05方法开发的,也适用于其它方法,如AACC 
Method 32-21,AACC method32-06。

2. 检测原理 

脱脂(如大于10%)干燥后的样品经热稳定a-淀FEN酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶酶解消化,酶解液通过乙醇沉淀、过滤,乙醇和丙酮洗涤残渣后干燥、称重,得到总膳食纤维(TDF)残渣;

酶解液通过直接过滤、热水洗涤残渣,干燥后称重,得到不溶性膳食纤维(IDF)残渣;

滤液用乙醇沉淀,过滤、干燥、称重,得到可溶性膳食纤维(SDF)残渣。

TDF、IDF和SDF的残渣扣除蛋白质、灰分和空白即得TDF、IDF和SDF含量。

该检测试剂盒的主要优势在于直接提供高纯度的酶,酶的活力是标准化的,而标准化的a-淀FEN酶的活力在测量抗性淀粉是公认的。淀粉葡萄糖苷酶中基本没有纤维素酶,而其他常用的酶制剂中常含有这种污染物,这将导致溶解和低估β-葡聚糖。该试剂盒提供的酶都是稳定的液体,可以保存到试剂盒有效期,并且是直接应用液,不需要使用前再溶解。

3. 用途 

适用于检测谷物、水果、蔬菜和加工食品中的总膳食纤维(TDF)、不溶性

膳食纤维(IDF)和可溶性膳食纤维(SDF)的检测。

4. 提供试剂及材料 

每一个盒中的提供的酶试剂足够进行200个试验,如另外需要可单独订货:

4.1热稳定a-淀粉酶

4.2蛋白酶

4.3淀粉葡萄糖苷酶

5. 需要的设备和试剂

5.1 设备

A. 高型无导流口烧杯:400mL或600mL

B. 坩埚:具粗面烧结玻璃板,孔径40-60 
μm。清洗后在马福炉中525℃灰化6小时或过夜,用真空泵除去硅藻土和灰分,室温下用2%清洗液浸泡1小时,用水和蒸馏水冲洗干净,用15 
mL丙酮冲洗后风干,加1g硅藻土到干燥的坩埚中,在130℃干燥至恒重,在干燥器中冷却1小时,记下坩埚(包括硅藻土)的重量。

C. 真空溶剂过滤装置:真空泵或有调节装置的抽吸器,1L的抽滤瓶,侧壁有抽滤口,以及抽滤瓶配套的橡胶塞。用于酶解液的抽滤。

D. 恒温振荡水浴:95-100℃

E. 分析天平:感量0.1mg

F. 天平(台秤):4 000g量程,感量0.1g

G. 马福炉:525±5°C,

H. 烘箱:103±2℃,130±3℃

I. 真空干燥箱

J. 干燥器:二氧化硅或等同干燥剂

K. PH计,具有温度补偿功能。

L. 微量凯氏定氮仪。

M. 移液器,50-200 μL,5 mL,一次性移液吸头。

N. 计时器。

O. 橡胶刮勺

P. 磁力搅拌器

5.2 试剂

A. 95%乙醇(体积比),

B. 78 %乙醇:取821mL95%乙醇置于容量瓶中,用水稀释到刻度,混匀。

C. 丙酮

D. 蒸馏水或去离子水

E. 清洗液Micro (International Products Corp.,Trenton,NJ).,配成2%液体

F. MES/TRIS缓冲液(0.05mol/L):称取19.52g (MES) (Sigma, M 8250)和14.2 g

(TRIS) (Sigma,T1503),用1.7L蒸馏水溶解,用6mol/L氢氧化钠调节PH至

8.2±0.1,加水稀释到2L(注意24℃时PH值为8.2,20℃时PH值为8.3,27-28℃

时PH值为8.1)

G. 盐酸溶液(0.561 mol/L):取93.5mL 6 mol/L的盐酸,加入700mL水中,混匀

后用水定容到1L。

H. 氢氧化钠

I. PH值标准缓冲液:PH值为 4.0,7.0 和10.0。

6. 酶的纯化和标准化

6.1 根据AACC/AOAC的膳食纤维检测方法,必须确保酶的纯度。

6.1.1 淀粉葡萄糖苷酶被木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶污染,会低估β-葡聚糖、

阿拉伯木聚糖和果胶的含量。

6.1.2 热稳定a-淀粉酶被污染,会影响抗性淀粉的测量。

6.1.3 蛋白酶被4-β-葡聚糖酶污染,会低估β-葡聚糖的含量。

6.1.4 如不是使用该的酶,请参考下面方法测定。

Test Sample

Activity Tested

Sample Wt(g)

Expected Recovery (%)

Citrus pectin

Pectinasea 『1』

0.1

90-95 『3』

?-Glucan (barley)

?-glucanase (cellulase) 『1』

0.1

95-100

Wheat starch

Amylase 『2』

1.0

0-1

Casein

Protease 『2』

0.3

0-2

High amylose starch

Amylase

1.0

~30 『4』

注解:

『1』:没有酶活力作用。

『2』:最大酶活力作用

『3』:除很少量的柑橘果胶全部沉淀

『4』:含有大量抗性淀粉,准确回收率的数值影响热稳定a-淀粉酶的使用量。

6.2 根据AACC/AOAC的膳食纤维检测方法,必须对酶标准化测定,如果不是使用该的酶,请按以下方法测定

6.2.1 淀粉葡萄糖苷酶,0.2 mL,

--- 酶活力表示方法1:淀粉/葡萄糖酶-过氧化物酶法,3300 U/mL,1个酶活力单位定义为:40°C,PH值4.5时,每分钟释放1 
μmol葡萄糖所需要的酶量。

--- 酶活力表示方法2:对-硝基苯基-b-麦芽糖苷(PNPBM)法,200 U/mL, 
1个酶活力单位(1PNP单位))定义为:40°C,有过量萄糖苷酶存在下,每分钟从对硝基苯基-β-麦芽糖苷释放1 μmol 对硝基苯基所需要的酶量。

6.2.2 热稳定a-淀粉酶,0.05 mL,

--- 酶活力表示方法1:以淀粉为底物,以Nelson/Somogyi还原糖表示,10000U/mL 
,1个酶活力单位定义为:40°C,PH值6.5时,每分钟释放1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

--- 酶活力表示方法2:对硝基苯基麦芽糖为底物,3,000 U/mL(Ceralpha),1个酶活力单位定义为:40°C,PH值6.5时,每分钟释放1 
μmol对-硝基苯基所需要的酶量。

6.2.3 蛋白酶,0.10 mL

--- 酶活力表示方法1:酪蛋白测试,350 U/mL或50 mg/mL或7 Tyrosine 
U/mL,1个酶活力单位定义为:40°C,PH值8.0时,每分钟从可溶性酪蛋白中水解出(并溶于三氯乙酸)1 μmol酪氨酸所需要的酶量。

--- 酶活力表示方法2:偶氮酪蛋白测试,350 U/mL或50 mg/mL或7 Tyrosine 
U/mL,1个内肽酶活力单位定义为:40°C,PH值8.0时,每分钟从可溶性酪蛋白中水解出(并溶于三氯乙酸)1μmol酪氨酸所需要的酶量。该偶氮酪蛋白(货号:S-AZCAS).

7. 检测步骤

7.1 试样制备

准确称取双份试样各1 g,质量差小于0.005g,精确到0.1mg,置于400mL或600mL高型烧杯中,同时制备双份空白样,在每个烧杯中加入40 mL 
PH值8.2的MES-TRIS缓冲液,磁力搅拌,直到试样完全分散到缓冲液中。

7.2 热稳定a-淀粉酶酶解:加入50 
μL热稳定a-淀粉酶溶液,加盖铝箔,置于95-100°C恒温振荡水浴中持续振摇,当所有烧杯全部放入水浴开始计时,反应35分钟。

7.3 冷却:将烧杯取出玲却到60°C,除去铝箔盖,用刮勺将烧杯内壁和底部的胶状物刮下,用10 mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。

7.4 蛋白酶酶解:在每个烧杯中各加入100 
μL蛋白酶溶液,加盖铝箔,置于60°C恒振荡水浴中,当烧杯内温度达到60°C开始计时,持续反应30分钟。

7.5 PH值调节:反应30分钟后,边搅拌边加入0.561 mol/L盐酸,严格控制60°C,用 1mol/L氢氧化钠溶液或 
1mol/L盐酸溶液,控制PH值在4.5±0.2。

7.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解:在上述溶液中边搅拌边加入200 
μL淀粉葡萄糖苷酶溶液,加盖铝箔,置于60°C恒温振荡水浴中,持续振摇,当烧杯内温度达到60°C开始计时,反应30分钟。

8. 测定

8.1 不溶性膳食纤维测定:

8.1.1 
过滤洗涤:试样酶解液全部转移到坩埚中过滤,残渣用10mL预热到70°C的蒸馏水洗涤两次,合并过滤液,转移至另一600mL高脚烧杯中,备测可溶性膳食纤维。残渣分别用10mL 
95%乙醇和丙酮洗涤两次,抽滤去除洗涤液,将坩埚连同残渣在103°C烘干过夜,将坩埚置于干燥器中冷却1小时,称重(包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土),精确至0.1mg,减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣质量。

8.1.2 
蛋白质和灰分测定:称完质量的残渣和硅藻土的混合物,一份用凯氏定氮法,以N×6.25为换算系数,计算蛋白质质量。另一份在525°C灰化5小时,于干燥器中冷却,精确称量坩埚总量(精确至0.1mg)减去坩埚和硅藻土干重,计算灰分质量。

8.2 可溶性膳食纤维测定

8.2.1 计算滤液体积:将不可溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600mL的高型烧杯中,通过烧杯+滤液总重扣除烧杯质量的方法估算滤液的体积。

8.2.2 沉淀:将滤液加入4倍体积预热60°C的95%乙醇,或取80g滤液加入320mL预热60°C的95%乙醇室温下沉淀1小时。

8.2.3 过滤:在干燥的坩埚中加入1g硅藻土,70°C真空干燥至恒重,记录坩埚的质量(精确到0.1mg)。用15mL 
78%乙醇将硅藻土润湿,并用真空溶剂过滤装置在抽真空条件下,使硅藻土平铺于坩埚中。将样品酶解液缓慢转移至对应的坩埚中,抽滤。用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。

8.2.4 洗涤:分别用15mL 78%乙醇、15mL 
95%乙醇和15mL丙酮洗涤残渣各两次,抽滤去除洗涤液后,将坩埚连同残渣在105°C烘干过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1小时,称重(包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土),精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣质量。

8.2.5 
蛋白质和灰分测定:称完质量的残渣和硅藻土的混合物,一份用凯氏定氮法,以N×6.25为换算系数,计算蛋白质质量,另一份在525°C灰化5小时,于干燥器中冷却,精确称量坩埚总量(精确至0.1mg)减去坩埚和硅藻土干重,计算灰分质量。

8.3 总膳食纤维检测检测

8.3.1 
沉淀:在每份试样中加入预热至60°C的95%乙醇225mL(预热后的体积,如乙醇的温度超过65°C,则加入228mL),乙醇与样液体积比为4:1,取出烧杯,盖上铝箔,室温下沉淀1小时。建议改为:称量酶解液的质量,用天平加入4倍质量的预热的60°C的95%乙醇,4°C冰箱中沉淀过夜。

8.3.2 过滤:在干燥的坩埚中加入1g硅藻土,70°C真空干燥至恒重,记录坩埚的质量(精确到0.1mg)。用15mL 
78%乙醇将硅藻土润湿,并用真空溶剂过滤装置在抽真空条件下,使硅藻土平铺于坩埚中。将样品酶解液缓慢转移至对应的坩埚中,抽滤。用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。

8.3.3 洗涤:分别用15mL 78%乙醇、15mL 
95%乙醇和15mL丙酮洗涤残渣各两次,抽滤去除洗涤液后,将坩埚连同残渣在105°C烘干过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1小时,称重(包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土),精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣质量。

8.3.4 蛋白质和灰分测定:称完质量的残渣和硅藻土的混合物,一份用凯氏定氮

法,以N×6.25为换算系数,计算蛋白质质量。,另一份在525°C灰化5小时,

于干燥器中冷却,精确称量坩埚总量(精确至0.1mg)减去坩埚和硅藻土

干重,计算灰分质量。

9. 计算:

DF(%)=『(R1+R2)/2-p-A-B』/『(M1+M2)/2』*100%式中:

DF=样品中膳食纤维含量(TDF、IDF、SDF),%

R1 和R2=双份样品残渣的质量,单位为毫克(mg)

m1 和m2=双份样品的质量,单位为毫克(mg)

A=灰分的质量,

P=蛋白的质量

B=空白=(BR1+BR2)/2-BP-BA

BR1 和BR2=双份试样空白残渣的质量

BP=试样空白蛋白的质量

BA=试样空白灰分的质量

可以使用该的计算软件Mega-CalcTM进行自动计算。

方法二

根据AACC method 32-05 和AOAC Method 985.29方法测定

1. 仪器设备和同方法一

2. 试剂和溶液

a. 280±2.0 mL 95 %乙醇

b.10±0.5 mL 78 %乙醇

c. 50±0.5 mL缓冲液

d. 磷酸盐缓冲液(0.08mol/L,PH值6.0): 取1.400g Na2HPO4和9.68g NaH2PO4

溶解在700mL蒸馏水中,用水定容到1L,用PH计检查PH值。

e. 氢氧化钠溶液(0.275mol/L):去11g氢氧化钠溶解在700mL蒸馏水中,冷却转

移到容量瓶中,用水定容到1L。

f. 盐酸溶液(0.325 mol/L):取 325 mL 1.0 mol/L 盐酸置于容量瓶中,用水定容

到1L。

3. 样品准备

总膳食纤维的测定必须是低脂或无脂的干燥样品,取混匀后的样品于70°C真

空干燥过夜,干燥器中冷却,再称重记录重量损失,干样粉碎后过0.3-0.5 mm

筛,若试样不能加热,则冷冻干燥后再粉碎过筛。如果是高脂肪样品(> 10 %),

取经过干燥的样品分别用25mL石油醚脱脂三次,干燥后记录脱脂的质量损失,

最后计算总膳食纤维含量时进行进行校正,粉碎过筛后的干燥试样放在干燥

器中待用。

4. 分析步骤

准确称取双份试样各1 g,质量差小于0.005g,精确到0.1mg,置于400mL或

600mL高型烧杯中,同时制备双份空白样,在每个烧杯中加入50 mL PH值6.0

的磷酸盐缓冲液,磁力搅拌,直到试样完全分散到缓冲液中,控制PH值6.0±0.1。

4.2 热稳定a-淀粉酶酶解:加入50 μL热稳定a-淀粉酶溶液,加盖铝箔,置于沸腾

水浴中15分钟,每5分钟轻轻振荡一次。当烧杯内的温度到100°C开始计时,

总共大约30分钟。

4.3 冷却:将烧杯取出冷却到室温,加入10 mL 0.275mol/L 的氢氧化钠,调节

PH值在7.5±0.1。

4.4 蛋白酶酶解:在每个烧杯中各加入100 μL蛋白酶溶液,加盖铝箔,置于60°C

恒振荡水浴中,当烧杯温度达到60°C开始计时,持续反应30分钟。

4.5 冷却:加入10 mL 0.325 mol/L盐酸,调节PH值在4.5±0.2。

4.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解:在上述溶液中边搅拌边加入200 μL淀粉葡萄糖苷酶溶

液,加盖铝箔,置于60°C恒温振荡水浴中,持续振摇,当烧杯内温度达到60°C

开始计时,反应20分钟。

4.7 在每份试样中加入预热至60°C的95%乙醇280mL(预热前的体积),乙醇与样

液体积比为4:1,取出烧杯,盖上铝箔,室温下沉淀1小时。

4.8 过滤:在干燥的坩埚中加入1g硅藻土,70°C真空干燥至恒重,记录坩埚的质

量(精确到0.1mg)。用15mL 78%乙醇将硅藻土润湿,并用真空溶剂过滤装置

在抽真空条件下,使硅藻土平铺于坩埚中。将样品酶解液缓慢转移至对应的

坩埚中,抽滤。用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。

4.9 洗涤:分别用20mL 78%乙醇洗涤3次、10mL 95%乙醇和10mL丙酮洗涤残渣

各两次,抽滤去除洗涤液后,将坩埚连同残渣在105°C烘干过夜或70°C真空

干燥过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1小时,称重(包括坩埚、膳食纤维残渣

和硅藻土),精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣质量。

4.10 蛋白质和灰分测定:称完质量的残渣和硅藻土的混合物,一份用凯氏定

氮法,以N×6.25为换算系数,计算蛋白质含量。另一份在525°C灰化5小时,

于干燥器中冷却,精确称量坩埚总量(精确至0.1mg)减去坩埚和硅藻土干重,

计算灰分质量。

计算:

未校正的平均空白残渣 (UABR)=平均试样空白残渣质量,单位为毫克

未校正空白蛋白残渣(BPR)=UABR x %空白蛋白/100

未校正空白灰分残渣(BAR)=UABR x %空白灰分/100

校正的空白(CB)= UABR - BPR - BAR

未校正的平均样品残渣 (USAR)=平均试样空白残渣质量,单位为毫克

未校正样品蛋白残渣(SPR)=UABR x %空白蛋白/100

未校正样品灰分残渣(SAR)=UABR x %空白灰分/100

校正的样品(CSR)= USAR-SPR-SAR-CB% TDF= 100 x CSR/样品质量mg最终的% 
TDF是去除了和水分后的总膳食纤维含量。

10、参考文献:

1. Association of Official Analytical Chemists (1985). Official 
Methods of Analysis, 14th ed., 1st suppl. Secs. 43, 
A14-43,A20, p.399.

2. Association of Official Analytical Chemists (1986). Changes in methods. 
J. Assoc. Off. Anal. Chem., 69:370.

3. Association of Official Analytical Chemists (1987). Changes in methods. 
J. Assoc. Off. Anal. Chem., 70:393.

4. Prosky, L., Asp, N.-G., Furda, I., DeVries, J.W., Schweizer, T.F.and 
Harland, B.F. (1985). Determination of total dietary fibre in foods and food 
products: Collaborative study. J. Assoc. Off. Anal.Chem., 
68:677.

5. Prosky, L., Asp, N.-G., Schweizer, T.F., DeVries, J.W. and Furda,I. 
(1988). Determination of insoluble, soluble, and total dietary fibre in

foods and food products. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 
71:1017.16

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